Wie man den Fleck graviert

W

Hitzefixierung des Abstrichs. Hitze fixiert die Bakterien auf dem Objektträger, so dass sie während des Flecks nicht so leicht abgespült werden. Führen Sie den Objektträger zwei- bis dreimal schnell durch eine Bunsenbrennerflamme oder erwärmen Sie ihn auf einem elektrischen Objektträgerwärmer. Überhitzen Sie die Proben nicht, da sie sich sonst verziehen können. Wenn Sie einen Bunsenbrenner verwenden, sollte die Flamme ein kleiner, blauer Kegel sein, nicht ein großer, orangefarbener.

Identifizieren Sie grampositive und gramnegative Bakterien. Untersuchen Sie den Objektträger unter dem Lichtmikroskop. Grampositive Bakterien erscheinen violett, da das Kristallveilchen in ihren dicken Zellwänden eingeschlossen ist. Gramnegative Bakterien erscheinen rosa oder rot, da das Veilchen durch die dünnen Zellwände gewaschen wurde, dann trat die rosa Gegenfärbung in sie ein.

Trocknen Sie den Schlitten. Sie können den Objektträger an der Luft trocknen lassen oder ihn mit einem zu diesem Zweck verkauften, saugfähigen Papier trocknen lassen. Der Gramm-Fleck ist vollständig.

Bereiten Sie sich auf die Laborarbeiten vor. Ziehen Sie Handschuhe an und binden Sie lange Haare zurück, um eine Kontamination der zu testenden Bakterienprobe zu vermeiden. Desinfizieren Sie einen Arbeitsplatz unter dem Abzug oder in einem anderen gut belüfteten Bereich. Überprüfen Sie vor Beginn die Funktionsfähigkeit des Bunsenbrenners und des Mikroskops.

Fügen Sie die Probe dem Objektträger hinzu. Sie können die Gram-Färbemethode verwenden, um Bakterien zu identifizieren, die in medizinischen Proben oder Bakterienkulturen in einer Petrischale vorkommen. Damit der Gramm-Farbstoff nützlich ist, tragen Sie eine dünne Schicht der Probe auf den Farbstoff auf. Eine Probe unter 24 Stunden wird empfohlen, da ältere Bakterien möglicherweise beschädigte Zellwände haben, die weniger vorhersehbar auf eine Gramm-Färbung reagieren.

Fluten Sie den Abstrich mit Gegenfärbung und spülen Sie ihn dann ab. Ein Gegenfärbemittel, typischerweise Safranin oder Fuchsin, wird verwendet, um zusätzlichen Kontrast zwischen gramnegativen und grampositiven Bakterien zu erzeugen, indem entfärbte (gramnegative) Bakterien rosa oder rot gefärbt werden. Mindestens 45 Sekunden einwirken lassen und dann abspülen.

Bewerten Sie gemischte Ergebnisse. Einige Bakterien sind aufgrund der Zerbrechlichkeit oder Wachsigkeit ihrer Zellwände schwer genau zu beflecken. Sie können eine Mischung aus violettem oder rosa Fleck in derselben Zelle oder zwischen verschiedenen Zellen im gleichen Abstrich haben. Jede Bakterienprobe, die älter als 24 Stunden ist, kann dieses Problem haben, aber einige Arten sind in jedem Alter schwer zu beflecken. Sie können spezialisiertere Tests erfordern, um die Identifizierung einzugrenzen, wie z.B. eine säurefeste Färbung, Beobachtung des Kulturwachstums, TSI-Mittelkulturen oder Gentests.

Identifizieren Sie gramnegative Bakterien. Gramnegative (rosa gefärbte) Bakterien werden oft in drei Gruppen eingeteilt. Kokken sind kugelförmige Bakterien, Stäbe sind lang, dünne Bakterien und Kokkoide Stäbe sind irgendwo dazwischen.

Positionieren Sie den Objektträger auf einem Färbeschale. Ein Färbeschale ist eine flache Metall-, Glas- oder Kunststoffschale mit einem kleinen Gitter- oder Drahtträger, der über die Oberseite läuft. Legen Sie den Objektträger auf diese Halterung, damit die von Ihnen verwendeten Flüssigkeiten nach unten in die Schale abfließen können.

Das Kristallviolett vorsichtig abspülen. Kippen Sie den Objektträger und verwenden Sie eine Reinigungsflasche, um einen kleinen Strom von destilliertem oder Leitungswasser über die Oberseite des Objektträgers zu spritzen. Das Wasser sollte über die Oberfläche des Abstrichs nach unten laufen, aber nicht direkt auf ihn gerichtet sein. Nicht übermäßig ausspülen, da dies den Fleck von grampositiven Bakterien entfernen könnte.

Identifizieren Sie grampositive Bakterien anhand ihrer Form. Bakterien werden durch ihre Form unter dem Mikroskop weiter klassifiziert, am häufigsten als Kokken (kugelförmig) oder Stäbchen (zylindrisch). Hier sind einige häufige grampositive (violett gefärbte) Bakterien, die nach Form organisiert sind:

Den Abstrich mit Jod überfluten, dann abspülen. Verwenden Sie eine Pipette, um den Abstrich mit Jod abzudecken. Mindestens 60 Sekunden ruhen lassen und dann mit der gleichen sorgfältigen Methode abspülen. Jod in Form von negativ geladenen Ionen interagiert mit CV zu großen Komplexen aus Kristallviolett und Jod (CV-I-Komplexe) innerhalb der inneren und äußeren Schichten der Zelle. Dadurch wird die violette Kristallviolettfarbe in der Zelle eingefangen, wo immer sie gefärbt ist.

Sterilisieren Sie einen Glasmikroskop-Objektträger. Wenn der Glasobjektträger verschmutzt ist, waschen Sie ihn in Seifenlauge, um Fett und Schmutz zu entfernen. Desinfizieren Sie den Objektträger mit Ethanol, Glasreiniger oder der von Ihrem Labor empfohlenen Methode.

Den Abstrich mit Kristallviolett überfluten. Verwenden Sie eine Pipette, um die Bakterienprobe mit mehreren Tropfen kristalliner Veilchenfarbe, manchmal auch Enzianviolett genannt, zu überfluten. Warten Sie dreißig bis sechzig Sekunden. Kristall-Violett (CV) dissoziiert in wässrigen Lösungen in CV – und Chlorid-(Cl-)-Ionen. Diese Ionen dringen durch die Zellwand und Zellmembran sowohl grampositiver als auch gramnegativer Zellen. Das CV -Ion interagiert mit negativ geladenen Komponenten von Bakterienzellen, um die Zellen lila zu färben.

Bereiten Sie das Lichtmikroskop vor. Legen Sie den Objektträger unter das Lichtmikroskop. Bakterien variieren stark in ihrer Größe, so dass die erforderliche Gesamtvergrößerung von 400x bis 1000x variiert. Am oberen Ende dieser Vergrößerungen wird eine Ölimmersionsobjektivlinse für mehr Klarheit empfohlen. Einen Tropfen Immersionsöl auf den Schlitten geben, dabei Bewegung während der Anwendung vermeiden, um Blasenbildung zu vermeiden. Bewegen Sie den Mikroskopturm so, dass die Objektivlinse einrastet und das Öl berührt.

Entsorgen Sie die Materialien. Die Entsorgungsverfahren sind je nach Labor und verwendetem Material unterschiedlich. Typischerweise wird die Flüssigkeit im Färbetray in verschlossenen Flaschen als Sondermüll entsorgt. Dias in einer 10%igen Bleichlösung einweichen und dann in scharfen Behältern entsorgen.

Fügen Sie eine Entfärbung hinzu und spülen Sie sie dann schnell ab. Eine 1:1-Mischung aus Aceton und Ethanol wird typischerweise für diesen kritischen Schritt verwendet, der sorgfältig geplant werden muss. Halten Sie den Schlitten schräg und fügen Sie dann die Entfärbung hinzu, bis im abfließenden Ablauf keine violette Farbe mehr sichtbar ist. Dies dauert in der Regel weniger als 10 Sekunden, oder sogar weniger, wenn die Entfärbung höhere Acetonkonzentrationen enthält. Stoppen Sie sofort, sonst entfernt die Entfärbung den kristallinen violetten Fleck sowohl von grampositiven als auch von negativen Zellen, und der Fleck muss wiederholt werden. Überschüssigen Entfärber sofort mit der früheren Technik abspülen.

Nachschlagen von Referenzbildern. Wenn Sie sich nicht sicher sind, was ein Bakterium ist, schauen Sie sich eine Sammlung von Referenzbildern an, sortiert nach Form und Ergebnis des Gramm-Flecks. Sie können Datenbanken online finden in der National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos und vielen anderen Seiten. Um die Identifizierung zu erleichtern, sind im Folgenden häufige oder diagnostisch wichtige Beispiele nach Grammstatus und -form sortiert.

About the author

Add comment

By admin

Your sidebar area is currently empty. Hurry up and add some widgets.